細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡
流式細胞術檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從---次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期組成。g0/g1期：有絲分裂發生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期g0期，而g0期從dna含量上無法與g1期區分，細胞開始rna和蛋白質的合成，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開始合成，細胞毒性實驗，細胞核內dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當dna成為4倍體時，細胞進入g2期。g2期細胞繼續合成rna及蛋白質，直到進入m期。
pi法是---的周期檢測方法。pi為插入性-熒光染料，細胞生物學，能選擇性的嵌入-dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與dna的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的dna分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。
一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-pi染色-流式細胞儀檢測。
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在之前，檢測ps的表達，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對ps有---的親和性，并且可以與暴露于細胞外的ps相結合。利用這一原理，可以將annexinv標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來區分凋亡和壞---。pi的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。
一般流程：細胞收集-pi-annexinv標記-流式細胞儀檢測。
結果示例：
圖 a 細胞周期檢測圖；b 細胞凋亡檢測圖
2、快速脂質體轉染法操作步驟如下 [方法二]：
(1) 以 5×105 細胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養皿) 培養 24 小時，使其達到 50～60% 板底面積。
(2) 在試管中配制 dna/脂質體復合物方法如下：
在 1 ml 無 dmem 中稀釋 psv2-neo 質粒 dna 或供體 dna。
旋轉 1 秒鐘，再加入脂質體懸液，湖北細胞，旋轉。
室溫下放置 5～10 分鐘，使 dna 結合在脂質體上。
(3) 棄去細胞中的舊液，用 1 ml 無 dmem 洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 ml dna/脂質體復合物，37℃ 培養 3～5 小時。
(4) 再于每孔中加入 20%fcs 的 dmem，繼續培養 14～24 小時，
(5) 吸出 dmem/dna/脂質體混合物加入新鮮 10%fcs 的 dmem，流式細胞實驗，2 ml/孔，再培養 24～48 小時。
(6) 用細胞刮或---法收集細胞，以備分析鑒定。
3、穩定的脂質體轉染方法如下：
(1) 接種細胞同前，細胞長至 50% 板底面積可用于轉染。
(2)dna/脂質體復合物制備轉染細胞同前 (2)、(3) 步驟。
(3) 在每孔中加入 1 ml、20%fcs 的 dmem，37℃ 培養 48 小時。
(4) 吸出 dmem，用 g418 選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染，方法參照細胞篩選法進行。
小鼠精原gan細胞分離富集和培養
成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，僅占gao丸生精上皮細胞總數的 0.02～0.03%，精原gan細胞數量太少不利于體外培養.分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min，用胎牛xue清終止---，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(cd90.2)陽性cd117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，并在體外進行培養嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前cd117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，cd90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，cd117陰性cd90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 cd117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，cd90.2陽性細胞占56.98±4.51%，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，cd117陰性cd90.2陽性細胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無---性(p>;0.1)，cd90.2陽性細胞和cd117陰性和cd90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經facs分選后獲得細胞純度
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