16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？
答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是-pcr擴增，不可能-擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能-100%正確。要知道，引物合成中發生錯誤非人為因素的頻率，比任何高保-溫聚合酶pcr擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，pcr檢測，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。
17.如果測序發現突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和-合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的-是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。
甲l基化特-的pcr
herman 等 1996 在使用重-酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用--鹽處理基因組dna，所有未發生jia基化的胞嘧定被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設計針對jia基化和非jia基化序列的引物進行pcr。通過電泳檢測msp擴增產物，如果用針對處理后jia基化dna鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在jia基化；反之，說明被檢測的位點不存在jia基化。
特點：適用范圍廣，巴中pcr，能夠檢測特異位點是否發生jia基化。
--鹽測序法bisulfite sequencing pcr，bsp
--鹽修飾后測序法 bsp frommer 等 1992 提出的研究 dna jia基化方法，此方法-性及jing確度高，能明確目的片段中每一個 cpg 位點的jia基化狀態。用--鹽處理基因組dna，所有未發生jia基化的胞嘧ding被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設計bsp引物進行pcr，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對pcr產物進行測序就可以判斷cpg位點是否發生jia基化，稱為bsp-直接測序法。將pcr產物克long至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為bsp-ke隆測序法。
特點：jing確度高，能夠準確檢測出jia基化的程度百分比。
18.引物是經過page純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論-析型page變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備page電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，fish檢測，page純化的引物，-怎么做，-是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少od數，引物遇到的問題可能就會少一些。
19. taqman 探針設計的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆taqman 探針位置盡可能靠近擴增引物擴增產物50-150bp，但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆g-c含量控制在40-80%左右。
◆避免連續相同堿基的出現，-是要避免gggg或更多g出現。
◆在引物的5端避免使用g。
◆選用比較多的堿基c。
◆退火溫度tm控制在 68-70c 左右。
有用的熒光染料參數
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