通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在---細(xì)胞20-30分鐘后可以---提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無(wú)培養(yǎng)液稀釋dcfh-da，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的dcfh-da中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升，廣西pcr，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，熒光定量pcr，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dcfh-da。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照及自己感興趣的---細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后---細(xì)胞。通�；钚匝蹶�(yáng)性對(duì)照在---細(xì)胞20-30分鐘后可以---提高活性氧水平。
2.、檢測(cè)
對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共---顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共---顯微鏡直接觀察也可以。
染色質(zhì)免l疫共沉淀技術(shù)(chip)
基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit， chip)技術(shù)可以真實(shí)、完整地反映結(jié)合在dna序列上的調(diào)控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)tf與promoter的結(jié)合情況，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來(lái)，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等---主要通路的一-種非常有效的工具。
染色質(zhì)免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與---(dna或rna)之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)f與promoter相互結(jié)合時(shí)，pcr引物設(shè)計(jì)，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。固定的蛋白質(zhì)dna復(fù)合物通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為-定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段然后通過(guò)抗原抗l體的特---識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特---地富集目的蛋白結(jié)合的dnal片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與dna相互作用的信息。通過(guò)qpcr或二代測(cè)序，篩選與目的蛋白互作的未知dna信息。
rna pull down 檢測(cè)
rna pull down：rna沉淀檢測(cè)，是檢測(cè)rna結(jié)合蛋白與其靶rna之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。使用體外轉(zhuǎn)錄將rna進(jìn)行生物素標(biāo)記，---，并與細(xì)胞蛋白裂解液孵育，形成rna-蛋白復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)磁珠結(jié)合后分離，復(fù)合物純化洗脫后通過(guò)western blot驗(yàn)證檢測(cè)特性的蛋白。若篩選可能結(jié)合的蛋白通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)篩選。
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