9.如何計(jì)算引物的tm值？
答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出tm，與引物長(zhǎng)度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。
長(zhǎng)度為25mer以下的引物，tm計(jì)算公式為：
tm = 4℃ (g + c)+ 2℃ (a + t)
對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸，fish檢測(cè)，tm計(jì)算公式為：
tm = 81.5 + 16.6 x log10[na+] + 0.41 (%gc) - 600/size
公式中，pcr引物設(shè)計(jì)，size = 引物長(zhǎng)度。
tm的定義：tm = temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. in the absence of destabilizing agents， like formamide/urea， tm will depend on 3 major parameters: the sequence: a gc-rich sequence has a higher melting temperature. the strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation，pcr檢測(cè)， which results in a higher melting temperature. the salt concentration: high ionic strength results in a higher tm as cati stabilize the dna duplexes.
蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定服務(wù)
蛋白質(zhì)protein是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物和生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、---、抵御外來(lái)物質(zhì)入l侵及控制遺傳信息等方面都起著重要的作用。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是---酸序列，通過(guò)鑒定---酸序列來(lái)匹配它的蛋白質(zhì)，這是定性研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)之一。
質(zhì)譜一般由離子源、分析器mass ---yzer和離子檢測(cè)器detector三部分組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)和電噴霧電離質(zhì)譜(esi-ms)等，質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的途徑。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是：以生物質(zhì)譜技術(shù)為，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行-、高通量分離、鑒定和分析。
蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本原理是用蛋白酶將蛋白質(zhì)---成肽段混合物，經(jīng)maildi或esi等軟電離手段將其離子化，眉山pcr，然后通過(guò)分析器將具有特定質(zhì)核比的肽段離子分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)實(shí)際譜圖和理論上蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶---后產(chǎn)生的一級(jí)質(zhì)譜峰圖和二級(jí)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行的比對(duì)，進(jìn)行蛋白鑒定。
1、細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞傳到后，密度達(dá)到70％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取兩個(gè)ep管，一個(gè)加入opti-mem、質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個(gè)加入opti-mem、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細(xì)胞孵育：將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；
4、收集---：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢---的上清；
5、滴度檢測(cè):細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入---上清液，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。
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