小鼠精原gan細胞分離富集和培養
成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，僅占gao丸生精上皮細胞總數的 0.02～0.03%，精原gan細胞數量太少不利于體外培養.分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min，細胞遷移實驗，用胎牛xue清終止---，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(cd90.2)陽性cd117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，并在體外進行培養嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前cd117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，293t細胞，cd90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，cd117陰性cd90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 cd117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，cd90.2陽性細胞占56.98±4.51%，重慶細胞，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，cd117陰性cd90.2陽性細胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無---性(p>;0.1)，cd90.2陽性細胞和cd117陰性和cd90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經facs分選后獲得細胞純度
細胞elispot檢測
1．培養板的預處理：在24孔培養板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用pbs洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，pbs-t洗滌3次，每次3min；
3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，細胞實驗外包，1000r/min離心5min，hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度104-106/ml的細胞懸液，置37℃，5％co2條件下孵育2-4h，棄掉培養液，pbs-t洗滌3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根---化物酶結合的親合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明膠溶液用ph5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．顯色與計數：將培養板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。
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