大鼠shen小球內皮細胞分離培養
2.原代細胞培養:(1)shen臟原位灌洗:sd大鼠用25%烏拉坦腹整注-zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動脈，以無菌的冷hank液漱朱洗血.同時剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白，取出雙shen冰浴保存。
(2)shen小球分離:參照green等方法改進。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質后將皮質剪成約1-2mm的碎塊，流式細胞，輕碾shen皮質依次通過80.120和200目鋼篩。收集shen小球。
(3)shen小球---和培養；將提取的shen小球加人0.1% in 型膠原酶---后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數接種于鋪有1%明膠培養瓶內，加a配制好的內皮細胞培養液(mfm.hepes 20 mmnovl 20%胎牛xue清0. 66 u---/ml.血管內皮生長因子20 ng /ml、---鈉100 u/ml.青莓su100 u/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規換液.第3同進行純化。
三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，---實驗，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，感受態細胞，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發生---的現象開發出了此技術。無自噬時，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，商洛細胞，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
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