動物組織細胞基因組dna提取
操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g0.5cm3，盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶k
500ug/ml20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另
一離心管中。
2.加2倍體積異，-，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul te 重新溶解。可進行pcr反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行
3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，pcr，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/l氨加入2倍體積的無水-，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ，10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%-洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，-怎么做，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存備用。
10.吸取適量樣品于genequant上檢測濃度和純度。
分子與質粒載體構建
實驗原理
外源dna與載體分子的連接就是dna重組，pcr引物設計，這樣重新組合的dna叫做重組體或重組子。重組的dna分子是在dna連接酶的作用下，有mg2+、atp存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源dna分子進行連接。dna連接酶有兩種：t4噬菌體dna連接酶和大腸dna連接酶。兩種dna連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的dna分子連在一起的功能，而且t4噬菌體dna連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈dna分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高t4噬菌體dna連接酶濃度或增加dna濃度來提高平末端的連接效率。
t4噬菌體dna連接酶催化dna連接反應分為3步：，t4dna連接酶與輔助因子atp形成酶—amp復合物；然后，酶—amp復合物再結合到具有5磷酸基和3-切口的dna上，使dna腺苷化；后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。
dna重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)cip處理克服。
連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又-到短暫配對結構的穩定。
全轉錄組測序
全轉錄組是指特定組織或細胞在特定狀態下所有轉錄產物的總和，包括mrna和各種noncoding rna。我們知道生物體本身的轉錄過程是一個動態變化且十分復雜的分子作用網絡，如果只是對某個單一rna分子的研究，有時并不能準確的發現分子作用機制。而競爭性內源rna(cerna)理論闡述了一種全新的轉錄調控模式：cerna包括lncrna、circrna、mrna、假基因等分子能夠通過mirna應答元件microrna respe element， mre競爭性地結合相同的mirna來調節彼此的表達水平。舉個例子：mirna會導致基因沉默現象發生，而如果lncrna競爭性結合了mirna，從而影響了mirna基因沉默功能實現。
cerna是目前轉錄調控領域的-內容之一，通過全轉錄組研究能夠系統性的闡述cerna的分子作用機制。目前對全轉錄組簡便的方法就是構建2個測序-分別進行測序。標準的生物信息學分析能夠得到mrna、lncrna、circrna、mirna各自的研究內容，靶向調控網絡、cerna網絡、共表達網絡分析可以將這幾種rna聯合起來分析，從而發現新的調控網絡模型。去除rrna的鏈特--，含有的rna信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學分析能夠得到mrna、lncrna、circrna的鑒定及注釋信息。不過該-構建時會進行片段化選擇從而濾掉了small rna的信息，所以需要另外再構建一個small rna-，進行測序分析后可以得到mirna和其他small rna的鑒定及注釋信息。全轉錄組測序方案路線圖如下所示：
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