透射電鏡自噬小體檢測
胰酶---，---實驗，收集作用后的細胞，離心，山西細胞，先將細胞塊固定在2.5%成二醛和0.1%的pbs溶液中保存在4c中過夜。
再用---梯度脫水，接下來用環(huán)氧樹脂浸透并切成薄片。隨后超薄切片用銅網(wǎng)固定，后用重金屬---雙氧-和檸檬酸鉛染色。通過tem分析凋亡細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化，拍照保存。
貼壁細胞:先倒出培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶---或者用細胞刮(會產(chǎn)生碎屑)刮下:帶培養(yǎng)液進行離心，100-1500/mim 5 10min。離心完畢倒出培養(yǎng)液。管底的細胞團不要打散， 沿管壁倒入適量(一般為材料體積的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定約1h-2h. 也可在4c冰箱過夜。
選擇實驗外包公司需要注意哪些事項？
技術(shù)支持
盡量有專門的技術(shù)負責對接項目，或者有技術(shù)服務(wù)群。隨時溝通項目問題，定期-實驗進展。這樣能把控實驗進度，結(jié)果數(shù)據(jù)有疑問也可以交流，不要實驗做完就沒人管了。
實驗數(shù)據(jù)
明確提供實驗原始數(shù)據(jù)、原始圖片，并有保密協(xié)議不外傳數(shù)據(jù)和客戶的信息。-實驗結(jié)果的完整性、唯獨性、真實性。這也是找實驗外包很關(guān)心的原則。另外結(jié)果盡量有實驗報告形式，包含所用材料、實驗步驟和結(jié)果統(tǒng)計分析，方便寫文章時直接使用。另外實驗都是有不確定性的，如果外包公司能-一定能做出預期的結(jié)果，那多半是不-的。做實驗不怕出問題，-外包公司會負責到底，有問題反饋再處理就好。
細胞實驗介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng)，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過表達慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化。純化后留取部分檢測---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測：將---顆粒使用梯度稀釋，分別293t細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據(jù)細胞熒光量計算---滴度。
細胞：在---前---對細胞進行計數(shù)，細胞毒性實驗，接種約10000個細胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋---，加入12孔板中對細胞進行，---數(shù)量根據(jù)細胞的moi加入若無moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細胞，6h后去除含---溶液，加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況。
實驗流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細胞----收集----純化----滴度檢測-細胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞鑒定
結(jié)果示例：
圖 a ---滴度檢測；b 目的細胞---效果圖
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