聚合酶鏈式反應(pcr)
操作步驟
1.在冰浴中，---怎么做，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
視pcr儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置pcr儀上執行擴增。-般:在93°c
預變性3-5min ，進入循環擴增階段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循環30-35
次，后在72°c保溫7min。
3.結束反應， pcr產物放置于4°c待電泳檢測或-20°c長期保存。
4. pcr的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油，需用100ul進行抽提反應混合液，以
除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測。
rna提取及注意事項
研究基因的表達和調控時，需要從組織或細胞中分離純化rna。rna的高低經常影響rt-pcr、cdna庫構建和northern blot等分子生物學實驗的成敗。
主要試劑
trizol是一種新型總rna抽提試劑，內含異硫---酸胍等物質，fish檢測，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的-酶。
1.
trizol試劑含有，具有毒性和---性，注重操作。
2.
rnase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴。
3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低后得率，因為一部分rna會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質結締組織和骨除外。在清洗和裂解細胞時在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源rnase降解了rna。
4. 酵母和一些---由于細胞壁的-結構，可以加入trizol試劑同時加入無rnase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
microrna芯片:
rna干擾(rna interference，北京pcr， rnai)現象是一種進化上保守的抵御---或外來---qin犯的防御機制。將含有靶基因mrna同源互補序列的rnadouble strand rna， dsrna導入細胞后，能夠特異地識別該mrna，引起mrna的降解，實時熒光定量pcr，從而導致相應的功能缺失。rnai提供了一種經濟、快捷、gao效的抑制特異基因表達的技術手段，該技術已被廣泛用于研究基因功能和chuan染性---及惡xingzhong瘤基因zhi療領域。目前常用的rna干擾手段為mirna、 shrna和sirna等。
mirna是一類可以通過rnai機制調節基因表達的內源性小rna，人工mirna與shrna的設計原理基本相同，由于mirna具有內源性，因此其更易產生有效的基因沉默。
技術流程：
dsrna或pre-mirna被導入細胞后，能夠被一種特異的-內切酶dicer識別并切割成為小片段，這些片段在rna解旋酶的作用下解鏈。繼之反義鏈在與體內一些酶包括內切酶、外切酶、解旋酶等結合形成rna-的沉默復合物rna-induced silencing complex，risc，risc與mrna同源區進行特---結合，若mirna與mrna的結合位點配對，則切割mrna；若mirna與mrna的結合位點不配對，則抑制mrna的翻譯。
登錄后臺
