brdu染色原理
brdu (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的dna，可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的dna中(細(xì)胞周期s期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著dna進(jìn)入子細(xì)胞中brdu特---可以用于檢測(cè)brdu的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。brdu特---可以用于檢測(cè)brdu的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。
注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗brdu單，icc染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性brdu存在，所以brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈dna內(nèi)的brdu，以氫鏈與腺呤結(jié)合，細(xì)胞周期，不能直接與抗brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)筨rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為---加熱、蛋白酶處理等，使dna雙鏈部分單鏈化，抗brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠igg孵育、
細(xì)胞傳代培養(yǎng)
操作步驟
1.將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。
2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止---。觀察---也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)zhen孔空隙時(shí)終止---。一般室溫---時(shí)間約為1- -3分鐘。
4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37°c下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。
附:---液配制方法:
稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無ca2+、mg2+的hanks液溶解，濾器過濾chu菌，4°c保存，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，用前可在379c下回溫。胰酶溶液中也可加入edta，使zui終濃度達(dá)0.02%。
細(xì)胞elispot檢測(cè)
1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用pbs洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，pbs-t洗滌3次，每次3min；
3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度104-106/ml的細(xì)胞懸液，置37℃，5％co2條件下孵育2-4h，廣西細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，pbs-t洗滌3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根---化物酶結(jié)合的親合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明膠溶液用ph5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。
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