三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，新疆細胞，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發生---的現象開發出了此技術。無自噬時，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，---，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，原代細胞，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，細胞培養技術，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
骨sui內皮祖細胞的分離培養
方法:使用密度梯度離
心法汲差速貼壁法聯合的方法培養內皮祖細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態變化，使用dil標記的---化低密度脂蛋白和fitc標記的荊豆凝集素1雙熒光染色、流式細胞儀檢測細胞表面抗原cd34、cd133 表達情況.結果與結論:培養前4 d---不明顯第5~10天迅速增殖，并可見細胞集落及線狀結構形成培養第7天的內皮祖細胞具有吞噬dil標記的---化低密度脂蛋白和fitc標記的荊豆凝集素1的功能流式細胞儀檢測體外培養第十天的細胞，cd133+細胞占19.2%，cd34+細胞占28.7%，cd34+ /cd133+細胞占19.1%.說明密度梯度離心法聯合差速貼壁法可在體外有效分離培養大鼠骨sui內皮祖細胞.
透射電鏡觀察自噬小體方法
利用光學顯微鏡，借助相應的染色方法，可以觀察細胞凋亡時會出現的一系列形態特征。常用的染色法包括臺盼藍、橙 / 化乙啶ao/eb、giemsa 和 he 法等。在光學顯微鏡下可以觀察到核固縮、質濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現象。
電鏡形態學觀察法是一種比較---、---的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下凋亡細胞表現為染色質凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發泡現象及凋亡小體出現等。
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