細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng)，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過(guò)表達(dá)慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化。純化后留取部分檢測(cè)---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測(cè)：將---顆粒使用梯度稀釋，分別293t細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算---滴度。
細(xì)胞：在---前---對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋---，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，---數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的moi加入若無(wú)moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞，6h后去除含---溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞----收集----純化----滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定
結(jié)果示例：
圖 a ---滴度檢測(cè)；b 目的細(xì)胞---效果圖
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：
細(xì)胞周期：指細(xì)胞從-次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期組成。g0/g1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期g0期，而g0期從dna含量上無(wú)法與g1期區(qū)分，細(xì)胞開(kāi)始rna和蛋白質(zhì)的合成，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開(kāi)始合成，細(xì)胞核內(nèi)dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當(dāng)dna成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入g2期。g2期細(xì)胞繼續(xù)合成rna及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入m期。
pi法是---的周期檢測(cè)方法。pi為插入性-熒光染料，能選擇性的嵌入-dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與dna的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的dna分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。
一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過(guò)夜-pi染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過(guò)程發(fā)生在之前，檢測(cè)ps的表達(dá)，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)ps有---的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的ps相結(jié)合。利用這一原理，可以將annexinv標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來(lái)區(qū)分凋亡和壞---。pi的膜通透性很差，渭南細(xì)胞，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。
一般流程：細(xì)胞收集-pi-annexinv標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
結(jié)果示例：
圖 a 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；b 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖
三、自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月?tīng)罨虮瓲睿p層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生---的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。無(wú)自噬時(shí)，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，gfp-lc3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，流式細(xì)胞技術(shù)，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測(cè)lc3-ii/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: lc3對(duì)lc3-ii有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
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