三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，單細胞測序技術，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發生---的現象開發出了此技術。無自噬時，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，細胞培養，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，流式細胞檢測，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
流式細胞分選
流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的--種現代細胞分析技術，它可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開并可實現單ke隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離，單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行速分選純化、高通量單分選或細胞芯片制備。分選后的細胞能直接用于培養、移植、-提取、單細胞pcr擴增或原位雜交等，瀘州細胞，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%，---樣本中目標細胞的高回收率。
大鼠主動脈內皮細胞的分離培養
方法：分離大鼠主動脈，直接貼壁于培養皿中，熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態，免yi組化ⅷ因子相關抗原染色鑒定細胞.結果:約24小時組織塊邊緣有游離的 新生細胞長出，7天即融合成片.---傳代后細胞呈短梭形或三角形，單層生長，鋪路石狀，ⅷ因子表達陽性，呈指數增殖.凍存后復蘇細胞活性均超過90%.結 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內皮細胞體外培養方法，凍存細胞存活率高，為體外研究提供了穩定的模型.
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