注意事項(xiàng)
1. 為了避免蛋白-性，不要對(duì)樣品劇烈攪動(dòng)和反復(fù)凍融。
2. 緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)。。
3. 為了避免蛋白質(zhì)的氧化，將 0.1～1 mmol/ldtt二硫蘇糖醇(或 β-巰加入到緩沖溶液中。
4. 為了避免重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞，將 1～10 mmol/ledta 金屬螯合劑加入。
5. 為了避免微生物生長(zhǎng)，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質(zhì)的時(shí)候，均必須時(shí)刻對(duì)它的穩(wěn)定性注意維護(hù)，使它的活性得到保護(hù)，需要牢記如下一些通用的注意事項(xiàng)。
6. 盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行操作。
7. 蛋白濃度不要太稀。
8. 除非是進(jìn)行-層。否則 ph 需要合適，pcr實(shí)驗(yàn)室，防止所使用的緩沖溶液 ph 與 pi 相同，使蛋白質(zhì)的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解；在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，將 dna 酶加入來(lái)使得 dna 降解，避免 dna 對(duì)蛋白的污染。
22.同樣的od用page檢測(cè)，eb染色為什么深淺不一？
答：通�？梢杂胑b染色的方法來(lái)判斷雙鏈dna的量(如質(zhì)粒dna)，因?yàn)閑b可以嵌合到雙鏈dna中。而合成的單鏈dna，由于堿基組成不同，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性不同，eb的染色程度也會(huì)有差異，比如oligo(dt)等不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，南充pcr，eb染色效果就非常差。所以不要用eb染色的方法來(lái)定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。同樣道理，用eb染色來(lái)照片不適合所有引物。
23.引物不純會(huì)有什么后果？
答：引物不純可能會(huì)導(dǎo)致：1)非特-擴(kuò)增；2)無(wú)法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物5′端酶切位點(diǎn)的酶切開(kāi)，-是沒(méi)有保護(hù)堿基的引物；3) 用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。
24.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了？
答：如果溶解引物的水ph過(guò)低或污染了菌或-酶，會(huì)使引物降解。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mmt ris ph7.5緩沖液溶解引物，因?yàn)橛行┱麴s水的ph值比較低ph4-5，fish檢測(cè)， 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒(méi)有問(wèn)題，而是pcr使用材料-是模板的與先前使用的不完全一致。
3.引物的od數(shù)如何定量？
答：引物合成引物od數(shù)是這樣測(cè)定的：用紫外分光光度計(jì)，波長(zhǎng)260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測(cè)定溶液的光密度。測(cè)定時(shí)溶液的光密度好稀釋到0.2-1.0之間。dna干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測(cè)od值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的od值。
4.需要什么級(jí)別的引物？
答：引物常用的純化方式脫鹽、biorp / opc純化、page純化、hplc純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購(gòu)引物的純度級(jí)別。
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