dna測(cè)序檢測(cè)
1. pcr測(cè)序反應(yīng)
(1)取0.2ml的pcr管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:
所加試劑測(cè)定模板管標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
bigdye mix
1μl
1μl
待測(cè)的質(zhì)粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)雙鏈dna
-1μ1
待測(cè)dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
滅菌去離子水
2μ 1
2μ 1
總反應(yīng)體積5μ 1，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊pcr管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2)將pcr管置于9600或2400型pcr儀.上進(jìn)行擴(kuò)增。98c變性2min后進(jìn)行pcr循環(huán)，
pcr循環(huán)參數(shù)為96c 10s， 50c 5s，fish檢測(cè)， 60°c4min， 25 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4c保溫。
2.-法純化pcr產(chǎn)物
(1) 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/-混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c離心30 min，小心棄上清。
(3)加70%(v/v)的-50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4c離心5min，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，小心棄上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.電泳前測(cè)序pcr產(chǎn)物的處理。
(1)加入12μ 1的tsr于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解dna沉淀，稍離心。
(2)將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml pcr管中，稍離心。
(3)在pcr儀上進(jìn)行熱變性(95c 2min)，冰中驟冷，銅川pcr，待_上機(jī)。
4..上機(jī)操作按儀器操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立
運(yùn)行的測(cè)序順序文件。
5.儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過
序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
6.測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。
外顯子測(cè)序
外顯子組測(cè)序exome-seq是對(duì)定向富集的基因組dna進(jìn)行高通量測(cè)序，它能夠以相對(duì)低的費(fèi)用對(duì)人類外顯子組進(jìn)行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測(cè)序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個(gè)外顯子組被測(cè)序。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏nimblegen、安捷倫、illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對(duì)市場(chǎng)上三個(gè)主流的外顯子組測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《nature biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、illumina和nimblegen的外顯子組測(cè)序平臺(tái)對(duì)同一個(gè)人類-樣品進(jìn)行分析。他們的結(jié) 果表明，nimblegen平臺(tái)作為一個(gè)使用高密度重疊探針的平臺(tái)，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測(cè)小的變異時(shí)所需的測(cè)序量也少。在同樣獲得80m測(cè)序數(shù)據(jù)的情況下，nimblegen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測(cè)序-，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是nimblegen和安捷倫平臺(tái)無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序wgs，顯示外顯子組測(cè)序能夠檢測(cè)到wgs錯(cuò)過的小變異。
除了文中提到了三個(gè)主流平臺(tái)，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏nimblegen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64m的基因組序列，包括外顯子以及mirna，-怎么做，它含與其他nimblegen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1m高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。
甲l基化特-的pcr
herman 等 1996 在使用重-酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用--鹽處理基因組dna，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)jia基化和非jia基化序列的引物進(jìn)行pcr。通過電泳檢測(cè)msp擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后jia基化dna鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在jia基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在jia基化。
特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測(cè)特異位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化。
--鹽測(cè)序法bisulfite sequencing pcr，bsp
--鹽修飾后測(cè)序法 bsp frommer 等 1992 提出的研究 dna jia基化方法，此方法-性及jing確度高，能明確目的片段中每一個(gè) cpg 位點(diǎn)的jia基化狀態(tài)。用--鹽處理基因組dna，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設(shè)計(jì)bsp引物進(jìn)行pcr，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷cpg位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為bsp-直接測(cè)序法。將pcr產(chǎn)物克long至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為bsp-ke隆測(cè)序法。
特點(diǎn)：jing確度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出jia基化的程度百分比。
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