平板克l隆形成實驗基本步驟::
1、取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰 蛋白酶---并吹打成單個細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛的dmem培養(yǎng)液中備用。
2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200 個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10ml 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37團(tuán)5% co2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。
3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%---固定細(xì)胞5ml固定15分鐘。然后去固定液，加適量gimsa應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細(xì)胞的數(shù)。后計算形成率。形成率= (數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) x100%平板形成試驗方法簡單，攀枝花細(xì)胞，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞- -定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。
q:中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？
a:基于多年的實驗研究，用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛以及其它中可能會存在以下種類的沉淀物：
1纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，單細(xì)胞測序，可以達(dá)到 1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為都是在低溫下進(jìn)行收集和快速處理的，細(xì)胞實驗室，一些纖維蛋白原可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過的過濾分裝后，就會在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。
2磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使出現(xiàn)渾濁，并且在 37℃ 培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)， 這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。
3膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。
雜交瘤細(xì)胞基因測序
雜交瘤細(xì)胞有丟失高特---高活性的風(fēng)險，細(xì)胞生物學(xué)，或者細(xì)胞狀態(tài)不好乃至。而經(jīng)過雜交瘤測序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來穩(wěn)定獲得；從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。同時還可以使用獲得的測序結(jié)果進(jìn)行等---方面的申請審批。有時為了進(jìn)一步-生產(chǎn)或進(jìn)行人源化等生物工程操作/修飾，有---了解雜交瘤所表達(dá)的對應(yīng)的基因序列以進(jìn)一步進(jìn)行生物工程操作與生產(chǎn)。
相較于直接對進(jìn)行基于蛋白質(zhì)分析的測序相比，得益于基因測序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測序可以提供的結(jié)果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險。
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