13.合成的引物5端是否有磷酸化
答：合成的引物5為---，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時直接在5′或3′端進行磷酸化，需要另外收費。
14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？
連接反應需要引物的5磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，實時熒光定量pcr，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要---引物退火的條件。sirna分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。
20.primer設計的基本原則是什么？
答：引物設計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer。
◆g-c含量控制在40-60%左右。
◆避免近3端有酶切位點或發夾結構。
◆如果可能避免在3端5個堿基有2個以上的g或c。
◆如果可能避免在3端1個堿基為a。
◆避免連續相同堿基的出現，---是要避免gggg或更多g出現。
◆退火溫度tm控制在 58-60c 左右。
◆如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。
21.為什么引物的od260/od280小于1.5 ？
答：引物應該全是dna，但是od260/od280的比值為什么那么低，fish檢測，怎么會有蛋白質污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？需要---的是od260/od280的比值不能用來衡量引物的純度。od260/od280的比值過低一般是由于引物中c/t 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的od260/od280的比值，清楚表明od260/od280的比值與引物的堿基組成密切相關。
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