7.如何檢測(cè)引物的純度？
答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用page方法。使用加有7m尿素的16%的聚---凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5od的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃，2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600v電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光tlc板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的。如果條件許可，也可以用eb 染色或銀染方式染色。
而有的廠家提供maldi-tof質(zhì)譜qc控制，從而保障了合成的準(zhǔn)確率：
bioneer使用多重maldi-tof質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動(dòng)裝載及監(jiān)測(cè)。 每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動(dòng)插入到寡核苷酸的信息單中。bioneer是上僅有的幾個(gè)對(duì)生產(chǎn)的每份核苷酸 (單個(gè)寡核苷酸和高通量和成) 都用maldi-tof質(zhì)譜儀檢測(cè)進(jìn)行核苷酸qc檢測(cè)的廠商，云南pcr，而且免費(fèi)提供質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
8.如何計(jì)算引物的濃度？
答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積微升按下列方式計(jì)算：v (微升)= od數(shù)*乘33 *乘*乘20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，---，按上述公式換算。
注意：1 od260= 33 ug/ml.
3、參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)---前后熒光的強(qiáng)弱。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)dcf。dcf的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
4、其它說(shuō)明
陽(yáng)性對(duì)照可以按照1：1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽(yáng)性對(duì)照---。通常---后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常---的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽(yáng)性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在---后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過(guò)快，可以適當(dāng)降低活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。
另外，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有---的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1：2000-1：5000稀釋dcfh-da，---怎么做，使裝載探針時(shí)dcfh-da的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
southern雜交
實(shí)驗(yàn)原理
southern印跡雜交southern blot是1975年由英---southern創(chuàng)建，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，是研究dna圖譜的基本技術(shù)。southern印跡雜交是進(jìn)行基因組dna特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)---性內(nèi)切酶---的dnal片段，將膠上的dna變性并在原位將單鏈dnal片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放l射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定dna分子的含量。
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