外顯子測序
外顯子組測序exome-seq是對定向富集的基因組dna進(jìn)行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進(jìn)行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏nimblegen、安捷倫、illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《nature biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、illumina和nimblegen的外顯子組測序平臺對同一個人類---樣品進(jìn)行分析。他們的結(jié) 果表明，nimblegen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，---多少錢，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80m測序數(shù)據(jù)的情況下，nimblegen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測序---，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是nimblegen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序wgs，顯示外顯子組測序能夠檢測到wgs錯過的小變異。
除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏nimblegen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64m的基因組序列，包括外顯子以及mirna，它含與其他nimblegen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1m高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。
3、參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測---前后熒光的強弱。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測dcf。dcf的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
4、其它說明
陽性對照可以按照1：1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對照---。通常---后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常---的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在---后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，遼寧pcr，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有---的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強，可以按照1：2000-1：5000稀釋dcfh-da，使裝載探針時dcfh-da的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
25.pcr擴增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的pcr擴增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決pcr擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式pcr就是擴增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴增， gc含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見：
1 rt-pcr。請注意，很多基因通過常規(guī)rt -pcr方法是很難擴增出來的。 rt- pcr成功的關(guān)鍵在于rt的反應(yīng)的rna和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。
2從基因組中擴增。一般情況下，pcr，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。基因組dna過高，會影響反應(yīng)體系中的mg和ph
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