9.如何計算引物的tm值？
答：引物設計軟件都可以給出tm，與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強度有關。
長度為25mer以下的引物，tm計算公式為：
tm = 4℃ (g + c)+ 2℃ (a + t)
對于更長的寡聚核苷酸，tm計算公式為：
tm = 81.5 + 16.6 x log10[na+] + 0.41 (%gc) - 600/size
公式中，size = 引物長度。
tm的定義：tm = temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. in the absence of destabilizing agents， like formamide/urea， tm will depend on 3 major parameters: the sequence: a gc-rich sequence has a higher melting temperature. the strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation，-， which results in a higher melting temperature. the salt concentration: high ionic strength results in a higher tm as cati stabilize the dna duplexes.
分子與質粒載體構建
實驗原理
外源dna與載體分子的連接就是dna重組，渭南pcr，這樣重新組合的dna叫做重組體或重組子。重組的dna分子是在dna連接酶的作用下，有mg2+、atp存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源dna分子進行連接。dna連接酶有兩種：t4噬菌體dna連接酶和大腸dna連接酶。兩種dna連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的dna分子連在一起的功能，而且t4噬菌體dna連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈dna分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高t4噬菌體dna連接酶濃度或增加dna濃度來提高平末端的連接效率。
t4噬菌體dna連接酶催化dna連接反應分為3步：，t4dna連接酶與輔助因子atp形成酶—amp復合物；然后，酶—amp復合物再結合到具有5磷酸基和3-切口的dna上，使dna腺苷化；后產生一個新的磷酸二酯鍵，-多少錢，把切口封起來。
dna重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)cip處理克服。
連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又-到短暫配對結構的穩定。
18.引物是經過page純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論-析型page變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備page電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，page純化的引物，-是長引物要的量都比較高，pcr實驗室，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少od數，引物遇到的問題可能就會少一些。
19. taqman 探針設計的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆taqman 探針位置盡可能靠近擴增引物擴增產物50-150bp，但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆g-c含量控制在40-80%左右。
◆避免連續相同堿基的出現，-是要避免gggg或更多g出現。
◆在引物的5端避免使用g。
◆選用比較多的堿基c。
◆退火溫度tm控制在 68-70c 左右。
有用的熒光染料參數
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