分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光定量pcr檢測
熒光定量pcr是檢測生物樣品中rna含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特---的探針，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記---，pcr檢測，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用sybr green和taqman法對rna含量進(jìn)行檢測。sybr green在低樣本量時(shí)成本較低，目前選用的較多。
sybr green i是一種只與dna雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與dna雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從dna雙鏈上釋放出來時(shí)，熒光信號急劇減弱。因此，---，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈dna分子的數(shù)量。sybr green熒光染料-量pcr的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)sybr green染料與dna雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、dna變性時(shí)，sybr green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成pcr產(chǎn)物。4、聚合完成后，sybr green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量pcr系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞或組織rna提取-rna濃度檢測-rna逆轉(zhuǎn)錄-定量pcr檢測。
結(jié)果示例：
圖 a 基因擴(kuò)增曲線圖；b 基因擴(kuò)增溶解曲線圖；c mrna相對表達(dá)量變化
從圖中可以擴(kuò)增曲線可以看出目的rna擴(kuò)增效果，內(nèi)江pcr，溶解曲線可以看出引物識(shí)別特---情況，通過使用δδct方法計(jì)算可以得到每個(gè)組中目的mrna表達(dá)變化。
單細(xì)胞rna測序
單細(xì)胞rna測序也稱scrna-seq。通常而言，一般的組織細(xì)胞rna-seq實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生1000萬個(gè)讀數(shù)，如果一個(gè)基因的頻率超過50rpkm，即每百萬讀數(shù)中每千個(gè)堿基中超過50個(gè)，這一基因即被認(rèn)為有表達(dá)。泊松分布下，1kb長的基因有超過500個(gè)讀數(shù)和4%的小變異系數(shù)，即cv值；哺乳動(dòng)物細(xì)胞通產(chǎn)含有200，000個(gè)mrna，因此至少要用50個(gè)單細(xì)胞一起才能到達(dá)小cv值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，為得到準(zhǔn)確的表達(dá)和細(xì)胞種類的識(shí)別，需要使用的細(xì)胞數(shù)量實(shí)際要更多。
rna提取
1.棄去培養(yǎng)液，用pbs清洗兩次1-2。
2.棄去pbs，用1000u1吸干凈殘余pbs。
3.加1ml trizol研磨b 41。
4. 1.5miep管標(biāo)號與每孔相對應(yīng)備用。
5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的 ep管中國。
6.往每個(gè)ep管中加入250ul，劇烈震蕩30s，實(shí)時(shí)定量pcr， 冰上靜置12min[問l。
7. 所有樣品4c離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時(shí)間: 15min.
8. 再次標(biāo)記一批同樣編號ep管。
9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號的ep管中，再加入400ul異充
分混勻。4c冰箱35min。
10. 4c離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時(shí)間: 10min.
11.棄去.上清液，加1m175%---，輕搖7]。
12. 4c離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間: 5min.
13. 棄上清液濾紙吸干。
14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測濃度。
組織rna提取
1、剪米粒大小組織塊放入ep管中標(biāo)號。
2、ep管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。
3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。
4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。
登錄后臺(tái)
