細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng)，細(xì)胞系，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過(guò)表達(dá)慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化。純化后留取部分檢測(cè)---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測(cè)：將---顆粒使用梯度稀釋，分別293t細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算---滴度。
細(xì)胞：在---前---對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋---，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，---數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的moi加入若無(wú)moi，需做---梯度：1，5，10，50，感受態(tài)細(xì)胞，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞，6h后去除含---溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，重慶細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞----收集----純化----滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定
結(jié)果示例：
圖 a ---滴度檢測(cè)；b 目的細(xì)胞---效果圖
脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
1、細(xì)胞h9c2 (hela) 6孔板hela1x10°/孔。
2、轉(zhuǎn)染前換上沒(méi)有抗sheng素的dmem+胎清(10%)。
3、將質(zhì)粒dna (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+dmem至50u1。
4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。
5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。
6、吸取混合物均勻加入每一個(gè)孔中。
7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基dmem6ml+胎清600u1+三抗300u1。
8、培養(yǎng)24小時(shí)。
自噬流檢測(cè)
自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性---，---是、神經(jīng)退行性---及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對(duì)于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)---研究領(lǐng)域的---。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。
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